免疫沉淀实验是一种生物医疗领域中不可或缺的重要技术，广泛应用于研究蛋白质相互作用及蛋白质表达状态。根据具体实验需求，通常可以采用不同的免疫沉淀方法，主要有磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。

磁珠免疫沉淀法

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合，以捕获目标蛋白。这种方法操作简便且快速，分离效率高，尤其适合于高通量筛选和自动化实验。通过磁性分离架进行快速分离，使实验步骤更加流畅。此外，这一方法在研究蛋白质-蛋白质相互作用及信号传导通路时显示出特别的优势。

固定免疫沉淀法

固定免疫沉淀法则采用固定化的抗体（通常偶联到珠子上）捕获目标蛋白，多用于样品准备，尤其是在蛋白质印迹法（Western Blot）之前。这种方法虽然需要更长时间的孵育以形成免疫复合物，但可以提供高特异性和灵敏度的结果，是定量分析目标蛋白表达和修饰状态的良好选择。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰及稳定性时尤为重要。

实验操作流程

所需溶液与试剂

（1）PBS缓冲液。
（2）1×细胞裂解缓冲液：20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1µg/ml 亮抑酶肽。
（3）3×SDS样品缓冲液：187.5mM Tris-HCl（pH 6.8, 25°C）、6% w/v SDS、30% 甘油、150mM DTT、0.03% w/v 溴酚蓝。

注：以上溶液均用超纯水制备。细胞裂解液在使用前需添加1mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。根据实验目的，添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞处理一段时间。
2. 去除培养基，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次。
3. 去除PBS，每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml 预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
4. 置于冰上孵育5分钟。
5. 从板上轻轻刮下细胞，转移至微量离心管，置于冰上。
6. 在冰上对样品超声处理四次，每次5秒。
7. 在4°C下微量离心10分钟，然后将上清液转移到一根新的试管中。
8. 如不进行后续实验，请将裂解物保存在-80°C。

2. 免疫沉淀法

1. 取200μl细胞裂解物，并添加10µl固定抗体，置于摇床上轻轻摇动，在4°C下孵育过夜。
2. 于4°C条件下微量离心30秒。
3. 用500µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗，离心去除上清，共清洗五次，洗涤间期保持样品于冰上。
4. 使用20μl 3×SDS样品缓冲液重悬沉淀物，涡旋振荡后微量离心30秒。
5. 加热样品到95-100°C，并持续2-5分钟。
6. 取15-30µl样品上样到SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质印迹实验。

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