近年来，二代建库测序的周期显著缩短，尽管第二代短读长测序技术在市场上仍占据主导地位，然而自2008年以来，第三代测序技术的发展也不容小觑。得益于其独特的长读长优势以及无需PCR扩增的特性，它能够实现对每一条DNA分子的独立测序，广泛应用于基因组拼接、病原体研究、突变鉴定等多个领域。

第三代测序原理

第三代测序技术，亦称为单分子DNA测序，采用现代光学、高分子及纳米技术，通过辨别碱基信号差异来直接读取序列信息。目前，商业化的主流技术包括新葡萄8883官网AMG旗下的PacificBiosciences SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies的纳米孔单分子技术。这两种技术的最大特点是单分子测序：SMRT技术利用荧光信号，而纳米孔技术则依赖不同碱基产生的电信号进行测序。

第三代测序的应用

目前，长读长测序的第三代测序平台已经在复杂动植物基因组、微生物基因组、全长转录组、微生物群体研究以及人类基因组变异检测等科研领域得到广泛应用。这些技术的应用旨在打破各领域检测技术的瓶颈，特别是在临床疾病检测中，第三代测序技术在基因组结构变异、短串联重复/微卫星、甲基化检测等遗传病及肿瘤基因检测中具有明显优势，基于这种技术的遗传病基因诊断产品层出不穷。

第三代文库制备的DNA/RNA质控

DNA和RNA的质量直接影响文库的制备，而不同的提取方法可能导致样品中化学试剂的残留，这会抑制酶的活性。此外，DNA/RNA的完整性也影响下游文库制备效率，从而影响最终的测序质量。文库制备的纯度要求较高，需无RNA或DNA、蛋白质污染，浓度需≥30 ng/uL，且完整性要求无降解，DNA脉冲场凝胶分析测量的平均片段大小应为30 kb，RNA RIN需≥8，样品量通常不少于1 μg。建议使用TE缓冲液长期存储高分子量（HMW）gDNA。

第三代文库制备的数据质控

与二代测序的碱基质量标准Q20/Q30不同，三代测序由于其碱基错误率的随机分布，单碱基的准确性不能直接反映数据质量。最直接的方法是观察测序数据的长度，长度短的测序数据并不一定意味着质量差，但质量差的数据长度通常较短。在文库的构建过程中，确保高质量文库的关键在于其构建品质。高质量的文库通常能产生长度更长、质量更高的数据。

在新葡萄8883官网AMG的质控方案中，PacBio测序数据QC包括数据产出（G）、酶读长、插入片段长度、subreads N50等；而纳米孔测序的数据QC则关注数据产出（G）、平均读长、平均质量值（Q）、Read length N50、最长reads长度及质量值，其中长度分布与平均Q值是最为重要的指标。

新葡萄8883官网AMG的三代建库产品选择指南

为满足客户的不同需求，新葡萄8883官网AMG独创研发多款适配Nanopore平台的建库试剂盒，帮助科研及临床检测实现更高效、精准的成果。